黃曲霉毒素（Aflatoxins, AF）是一類由黃曲霉和寄生曲霉產生的代謝產物，具有誘發人體致畸、致癌、致突變的作用，主要的污染物有黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2。中藥材大多以天然植物為基源，在儲存不當或因其他外界條件影響時，易受霉菌污染產生黃曲霉毒素。因此對中藥材進行黃曲霉毒素的高效便捷檢測是十分有必要的。

 

       2.儀器、試劑及耗材

       儀器

       Raykol Fotector Plus 高通量全自動固相萃取儀

       Raykol Auto EVA-60 全自動平行濃縮儀

       Raykol AH-30 全自動均質器

       Raykol Auto Prep 200 全自動液體樣品處理工作站

       高效液相色譜（HPLC）：Agilent 1200

       質譜檢測器 (MS)：Agilent 6430

       耗材

       黃曲霉毒素免疫親和柱

       試劑

       緩沖液：稱取25 g氯化鈉、5 g碳酸氫鈉溶于水中，加入0.1 mL吐溫-20，用水稀釋至1000 mL即得淋洗緩沖液。

       使用Auto Prep 200全自動液體樣品處理工作站配制黃曲霉毒素混合標準工作液。

 

       3.樣品提取與前處理

       陳皮、人參、當歸試樣前處理

       準確稱取15 g試樣于120 mL離心管中，加入3 g氯化鈉及75 mL甲醇-水溶液（7:3，V/V），12000轉/分鐘攪拌速度下均質2 min，離心5 min（轉速4000 r/min）。準確量取15 mL上層提取液于50 mL容量瓶中，用水定容、取30 mL至50 mL離心管中, 離心10 min（轉速4000 r/min），最后準確移取20 mL上清液至80 mL玻璃上樣管，待凈化用。

       凈化方法

      凈化過程采用黃曲霉毒素免疫親和柱進行富集凈化，具體方法如下：

       清洗樣品通道：用甲醇清洗；

       上樣：采用2 mL/min的流速進行精確上樣20 mL；

       淋洗：采用緩沖液和純水進行淋洗小柱；

       氣推：用60 mL空氣將水擠出免疫親和柱；

       洗脫：以0.5 mL/min的速度用甲醇進行洗脫，開始收集溶液；

       氣推：將柱子里溶液用空氣推出，收集溶液。

       將收集液用甲醇定容至2 mL，混勻后過0.22 µm濾膜用液質檢測。

 

       4.液質聯用色譜圖

 

       5.樣品測試

       基質標準工作曲線

       選擇定量離子的峰面積作為縱坐標，濃度作為橫坐標，做相關曲線，曲線為線性回歸，各點權重相等，擬合出工作曲線，要求R2>0.99。

       基質加標回收實驗

       在陳皮、人參、當歸3種常見樣品基質中添加水平為1.8 μg/kg的黃曲霉毒素G2、B2和6.0 μg/kg的黃曲霉毒素G1、B1進行加標回收驗證。

 

       6.總結

       A.提取液需加入水進行稀釋、定容至50 mL后才可進行凈化，以防止過多的有機溶劑使免疫親和柱失活。

       B.在人參和當歸的凈化過程中，如采用20 mL水作為淋洗液，其加標回收率為70~80%；而將10 mL的緩沖液和10 mL的純水作為淋洗液時，可除去免疫親和柱上殘留的色素和基質，從而提高回收率。

       C.進行洗脫時甲醇的過柱流速控制在1滴/s為宜。洗脫效果不佳時，可采取讓甲醇浸泡免疫親和柱后再加以洗脫。

       D.由于黃曲霉毒素在紫外光照射下不穩定，因此在實驗過程中應避免紫外光和太陽光的照射。

 

       7.解決方案優勢

       通過高通量全自動固相萃取儀進行凈化和富集，能自動化進行免疫親和柱自動脫帽和樣品上樣、淋洗和洗脫等過程，8種溶劑可選，6個樣品通道同時運行，能連續、批量處理多樣品，實現高通量、自動化固相萃取過程。

       整體解決方案可實現樣品快速高效處理，提高工作效率。同時自動化前處理解決方案可解放實驗人員雙手，也避免有機溶劑的毒害。