利用患者自身免疫系統(tǒng)消滅癌細胞的免疫療法為推進癌癥治療提供了巨大的希望。為了讓身體抵御癌癥，免疫細胞必須識別、接觸、殺死并最終清除腫瘤細胞。例如，免疫檢查點抑制劑（PD-1/PD-L1 和 CTLA-4 通路抑制劑）和細胞毒作用誘導劑（CD3xCD19 和赫賽汀）可以防止癌細胞逃逸免疫系統(tǒng)（Wei et al, 2018）。通過設計和引入 CAR-T 細胞來識別和殺死腫瘤細胞同樣提供了巨大的潛力，目前已有幾種細胞療法成功獲批上市（Strati and Neelapu, 2019）。而充分了解效靶細胞的相互作用過程是識別、驗證新靶點和細胞治療方法的關鍵。

 

       現(xiàn)在賽多利斯提供了一種基于 iQue 高通量流式分析系統(tǒng)和 Incucyte®  活細胞成像分析系統(tǒng)的聯(lián)合工作平臺與工作流程，用于全面評估免疫細胞體外實驗。在這一流程中可同時利用流式分析獲取表達譜和細胞健康標記產(chǎn)生關于細胞亞型、激活狀態(tài)和生存能力的信息，以及用活細胞成像分析獲取細胞相互作用和殺死腫瘤細胞的過程中的時間和空間信息。

 

       -具體流程如下

將帶有綠色熒光核標記的靶細胞以適當密度種于 96 孔板中。

       加入免疫細胞活化劑（如 CD3/CD28 Dynabeads），按不同效靶比加入不同密度的免疫細胞（如 T 細胞或 PBMC），及細胞毒/凋亡紅色熒光探針（如 Annexin V）。

       Incucyte® 在所需時間點對細胞成像，同時以適當間隔收取微量上清用于高通量流式分析細胞因子（IFNγ 和 TNFα）。

       完成殺傷實驗后將細胞消化移入 96 孔 V 型底板，并用 T 細胞活化檢測試劑盒標記 T 細胞活化標志蛋白。

       通過 iQue 高通量流式分析系統(tǒng)對整板細胞進行亞群分析和評估。

 

       細胞形態(tài)和空間接觸變化

       在活細胞成像結果中，與對照組相比可以顯著觀察到 CD3/CD28 Dynabeads 誘導培養(yǎng)體系中的 PBMC 細胞活化發(fā)生的形態(tài)學變化，提示了免疫細胞的激活。同時無論在非貼壁或貼壁共培養(yǎng)的腫瘤細胞體系中，均出現(xiàn)了明顯的效靶細胞空間接觸的增加。

 

       量化效靶細胞數(shù)量

       靶細胞數(shù)量的變化提示了免疫細胞誘導產(chǎn)生的細胞毒作用。Incucyte®  成像和 iQue 流式分析都可以提供可靠的靶細胞量化計數(shù)結果，并且具有高度的一致性，均顯示活化的 PBMC 對腫瘤細胞誘導產(chǎn)生了顯著的殺傷效應。

 

       細胞因子濃度-效靶細胞計數(shù)動態(tài)分析

       將由 iQue 量化的不同時間點的細胞因子濃度數(shù)據(jù)與對應時間點的 Incucyte®  圖像表型數(shù)據(jù)關聯(lián)起來，可為整個免疫殺傷實驗動態(tài)過程提供了更深入的洞察力。

 

       不同濃度 CD3 / CD28 Dynabeads 處理組的免疫細胞的細胞因子出現(xiàn)了不同水平的增加，且與 Dynabeads 呈現(xiàn)濃度依賴變化。IFNɣ 水平在實驗開始 24 h 后大幅增加，96 h 后達到最大濃度。TNFα 濃度增速更快，但在 72 h 達到最大水平后開始下降。在 48~60 小時后，效應細胞的增殖水平與細胞因子濃度呈正相關。而效應細胞殺傷引起的靶細胞數(shù)量降低也起始于這一時間段，靶細胞數(shù)量降低水平直接與效應細胞活化水平正相關。

 

       細胞亞群分析

       在殺傷實驗達到終點后，每孔細胞被收集用 iQue 高通量流式系統(tǒng)的 T 細胞活化試劑盒對 CD4 和 CD8 細胞上的早期活化（CD69）、中期活化（CD25）和晚期活化（HLA-DR）標志分析。CD69 和 CD25 需要單獨激活 T 細胞受體（TCR），而 HLA-DR 需要額外的 CD28 或抗原提呈細胞的共刺激。在未活化的對照組中，亞群分析顯示 CD8 陽性細胞中 CD69、CD25 或 HLA-DR 陽性細胞均為低水平。加入 CD3/CD28 Dynabeads 后則引起所有三個標志表達呈濃度依賴性升高。

 

       總結 

       在這一聯(lián)合應用中，通過 Incucyte®  自動動態(tài)圖像分析功能獲取形態(tài)學信息和對靶細胞計數(shù)，以及 iQue T 細胞激活和細胞因子分析試劑盒及 QBeads 用于細胞因子分析、細胞亞群分析。在本流程中，免疫細胞激活、腫瘤細胞死亡和細胞數(shù)量量化的形態(tài)學變化通過 Incucyte® 活細胞成像系統(tǒng)分析和闡明，而 iQue 高通量流式系統(tǒng)用于分析細胞因子釋放信息和細胞亞群。重要的是，Incucyte®  平臺上的實時數(shù)據(jù)分析可以為流式細胞分析的檢測時間點選擇提供了可靠的依據(jù)，聯(lián)合應用平臺使得兩種技術的效用實現(xiàn)了最大化。

 

       -儀器和試劑-

       Incucyte® 活細胞分析系統(tǒng)

 

       iQue3 高通量流式細胞儀

 

       T 細胞活化和細胞因子分析試劑盒

 

       Incucyte®  NucLight 慢病毒綠色熒光試劑

 

       Incucyte® Annexin V 紅色熒光試劑